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标志物LC3检测时需要注意的5大要点

发表时间:2023-11-07

自噬(autophagy)是由 Ashford 和 Porter 在 1962 年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的,是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome),并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。

自噬

自噬的功能

1.饥饿应答时的作用,在不同的器官如肝脏或在培养细胞中,氨基酸的匮乏会诱导细胞产生自体吞噬,由自体吞噬分解大分子,产生在分解代谢和合成代谢过程中所必须的中间代谢物。

2.在细胞正常活动中的作用,如在动物的变态发育、老化和分化过程中,自体吞噬负责降解正常的蛋白以重新组建细胞。尽管通常人们认为自体吞噬不具有选择性,但是在某些病理和压力条件下,通过自体吞噬能选择性地隔离某些细胞器,如线粒体、过氧化物酶体等。

3.在某些组织中的特定功能,如黑质的塞梅林神经节中,多巴胺能神经元中的神经黑色素的合成就需要把细胞质中的多巴胺醌用自噬囊泡包被隔离起来。

自噬过程的LC3

微管相关蛋白1轻链3 (LC3, MAP1LC3),是Atg8在哺乳动物中的同源物。LC3/Atg8 被具有蛋白内切酶活性的Atg4在羧基端剪切,生成胞浆型 LC3-I。在自噬形成时,胞浆型LC3-I通过Atg7 和 Atg3(分别对应泛素激活酶E1和泛素结合酶E2)参与的类泛素样反应,使磷脂酰乙醇胺 (PE) 偶联,生成脂质化形式的 LC3,也称作 LC3-II,它附着到自噬体(autophagosome)的膜上,是自噬体的结构蛋白,即自噬体膜型LC3-II。在降解过程中,位于自噬溶酶体外膜的LC3-II被半胱氨酸蛋白酶Atg4B切割,产生LC3-I循环利用;位于内膜的LC3-II则与包裹的内容物一起,被溶酶体降解。导致自噬溶酶体中LC3含量很低。

自噬过程的LC3

在哺乳动物中,存在 4 种LC3异构体(LC3A、LC3B、 LC3B2和 LC3C),在不同的组织细胞中表达会有差异。目前主要研究的是LC3A和LC3B,LC3C在许多细胞中表达量很低,研究的也较少。其中每种异构体都可以有I和II两种亚型。

在进行自噬研究时,检测 LC3-I 和 LC3-II 几乎是必做的实验,利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时,胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I,LC3-I跟PE结合转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。那么,进行 LC3 检测时,需要注意哪些要点呢?

1.需要知道样本的LC3表达量和表达的种类。不表达或者表达量很低样本,就不适合用于自噬的研究。使用LC3A或LC3B的抗体均可,使用LC3A/B抗体,同时检测两种,可以大大提高实验成功率。

2.LC3-I 和 II 存在一个生成-降解的动态过程,所以单时间点 LC3-II 的表达改变并不能体现自噬的改变,需要使用一些阻断溶酶体降解的药物(如氯喹、巴佛洛霉素 A1 等),判断在干预手段下,细胞的自噬程度的改变。氯喹可以通过抑制溶酶体功能(比如升高它的 pH 值),抑制 LC3-II 的降解;巴佛洛霉素 A1 则是一种强效 V-ATPase 抑制剂,阻断溶酶体依赖的降解。在「堵漏」的前提下,根据一段时间内 LC3-II 的积聚程度,判断自噬的改变。

3.目前的 LC3 抗体所检测的抗原表位都位于 LC3 的 N 端,由于 PE 基团结合可能导致 N 端区域的构象变化,使得抗体对 LC3-II 的亲和性更高,所以 LC3-II 条带显色深并不能代表该样本处于高自噬状态。另外,LC3-I 对反复冻融更为敏感,也更易在 SDS 上样缓冲液中降解。基于以上两个原因,在半定量时,除了使用 LC3-II/LC3-I 的比值外,也有科学家使用 LC3-II 与管家蛋白(Housekeeping Protein)的比值进行半定量。

4.LC3是膜相关蛋白,在细胞裂解后,对其进行冰上短暂超声,促进蛋白的溶解,将 LC3 从膜上解离。LC3-I 和 LC3-II 是小分子蛋白,虽然理论上LC3II分子量更大,由于带负电的PE改变了LC3II的性质,使其疏水性更强,导致其在电泳中迁移率更高。所以,LC3II电泳后停留在更小分子量(约14kDa)。

5.由于LC3-I 与 LC3-II 分子量小,又仅有 2 KD 差异,WB注意选用高浓度分离胶(约15%),转膜使用0.22μm转印膜,湿转70V,1.5h或半干转2.5A,7min。

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货号 名称 来源 应用
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FNab04717 LC3 antibody Rabbit polyclonal ELISA, WB, IHC, IF, IP
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